Estudio tridimensional de la ultraestructura de la corteza cerebral de la rata

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Anatomía, Histología y Neurociencia. Fecha de lectura: 11-01-2018Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 11-07-2019El objetivo de la presente tesis doctoral es contribuir al conocimiento de la microanatomía de la corteza cerebral. En concreto, hemos estudiado la distribución, forma y tamaño de las sinapsis, así como de las mitocondrias presentes en el neuropilo de la corteza somatosensorial de la rata. Para llevar a cabo este estudio se han utilizado técnicas de microscopía electrónica tridimensional y técnicas estereológicas. El neuropilo es la región de la corteza cerebral dónde se establecen la mayoría de las conexiones sinápticas. Estas conexiones se dan entre axones, que pueden ser excitadores o inhibidores, y dendritas. En numerosas ocasiones las dendritas presentan protuberancias de la membrana en forma de espinas, siendo éstas el principal elemento postsináptico de las sinapsis excitadoras. En la presente tesis hemos analizado la densidad y distribución de las sinapsis en el neuropilo de la corteza somatosensorial primaria de la rata de catorce días de edad postnatal. Nuestros resultados indican que las sinapsis asimétricas superan numéricamente a las simétricas en una proporción de 9:1, y que tanto las sinapsis asimétricas como las simétricas son más numerosas en la capa IV y menos numerosas en la capa VI. Hemos estudiado también la localización de estas sinapsis en tallos y espinas dendríticas, observando que las sinapsis en espinas superan a las sinapsis en tallos dendríticos en una proporción de 8:2. De esta manera la mayoría de las sinapsis en el neuropilo son asimétricas en espinas, seguidas de asimétricas en tallos dendríticos, simétricas en tallos y por último simétricas en espinas. Dada la relación entre la estructura y la función de las sinapsis, hemos estudiado el tamaño y la forma de las uniones sinápticas. Al igual que otros parámetros, como la fuerza sináptica o la amplitud de los potenciales postsinápticos, la distribución de los tamaños de las uniones sinápticas se ajusta a una distribución log-normal. Nuestros resultados ponen de manifiesto que las uniones sinápticas asimétricas son, en promedio, más pequeñas que las simétricas en todas las capas corticales. En ambos casos las más grandes se encuentran en la capa III y las más pequeñas en la capa IV. La mayoría de las sinapsis corticales tienen una densidad postsináptica de forma discoidal o macular, no obstante, un pequeño porcentaje presenta perforaciones o un perímetro en forma de herradura. Las sinapsis perforadas y en herradura son, de media, más grandes que las maculares, aunque no está claro que pertenezcan a distintas poblaciones de sinapsis. En nuestro estudio hemos encontrado además que la curvatura de las uniones sinápticas es mayor para las sinapsis simétricas que para las asimétricas, aunque no hay correlación entre la curvatura y el área de las uniones sinápticas. Por último, en esta tesis hemos analizado la densidad de mitocondrias en el neuropilo, su distribución en axones y dendritas, y su relación con las sinapsis, dado que el cerebro tiene un consumo metabólico muy elevado, en gran parte debido a la actividad sináptica. La mayor fracción de volumen mitocondrial se encuentra en la capa IV y la menor en las capas I y VI. Las dendritas tienen más mitocondrias que los axones, lo que probablemente está relacionado con un mayor consumo energético a nivel postsináptico. En el caso de los axones, pese a que globalmente hay más mitocondrias localizadas en axones excitadores que en inhibidores, los inhibidores tienen mayor proporción de mitocondrias . Hemos encontrado, además, una correlación entre la densidad de sinapsis en el neuropilo y la fracción de volumen mitocondrial. Uno de los primeros pasos para comprender la organización funcional del cerebro es conocer su diseño estructural, y correlacionarlo con las características moleculares y fisiológicas de las células estudiadas. De este modo, los resultados aquí presentados ayudarán a entender mejor la estructura de los microcircuitos, a describir el sinaptoma y a construir modelos corticales más realistas

Haptically assisted connection procedure for the reconstruction of dendritic spines

Dendritic spines are thin protrusions that cover the dendritic surface of numerous neurons in the brain and whose function seems to play a key role in neural circuits. The correct segmentation of those structures is difficult due to their small size and the resulting spines can appear incomplete. This paper presents a four-step procedure for the complete reconstruction of dendritic spines. The haptically driven procedure is intended to work as an image processing stage before the automatic segmentation step giving the final representation of the dendritic spines. The procedure is designed to allow both the navigation and the volume image editing to be carried out using a haptic device. A use case employing our procedure together with a commercial software package for the segmentation stage is illustrated. Finally, the haptic editing is evaluated in two experiments; the first experiment concerns the benefits of the force feedback and the second checks the suitability of the use of a haptic device as input. In both cases, the results shows that the procedure improves the editing accuracy

Volume electron microscopy of the distribution of synapses in the neuropil of the juvenile rat somatosensory cortex

Knowing the proportions of asymmetric (excitatory) and symmetric (inhibitory) synapses in the neuropil is critical for understanding the design of cortical circuits. We used focused ion beam milling and scanning electron microscopy (FIB/SEM) to obtain stacks of serial sections from the six layers of the juvenile rat (postnatal day 14) somatosensory cortex (hindlimb representation). We segmented in three-dimensions 6184 synaptic junctions and determined whether they were established on dendritic spines or dendritic shafts. Of all these synapses, 87?94% were asymmetric and 6?13% were symmetric. Asymmetric synapses were preferentially located on dendritic spines in all layers (80?91%) while symmetric synapses were mainly located on dendritic shafts (62?86%). Furthermore, we found that less than 6% of the dendritic spines establish more than one synapse. The vast majority of axospinous synapses were established on the spine head. Synapses on the spine neck were scarce, although they were more common when the dendritic spine established multiple synapses. This study provides a new large quantitative dataset that may contribute not only to the knowledge of the ultrastructure of the cortex, but also towards defining the connectivity patterns through all cortical layers

Método de reconstrucción con un dispositivo háptico de espinas dendríticas

En dicho método, a partir de una imagen tridimensional inicial de dichas espinas dendríticas, se realizan las siguientes etapas: (1) seleccionar un isovalor, (2) seleccionar con un dispositivo háptico dos puntos en dicha imagen tridimensional, (3) establecer un recorrido entre estos dos puntos e (4) incrementar con el dispositivo háptico los valores de intensidad de señal en los vóxeles situados alrededor de dicho recorrido y generar una imagen tridimensional final que contiene una completa reconstrucción de dichas espinas dendríticas.Peer reviewedUniversidad Rey Juan Carlos, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universidad Politécnica de MadridB2 Patente con examen previ

Método de reconstrucción con un dispositivo háptico de espinas dendríticas

En dicho método, a partir de una imagen tridimensional inicial de dichas espinas dendríticas, se realizan las siguientes etapas: (1) seleccionar un isovalor, (2) seleccionar con un dispositivo háptico dos puntos en dicha imagen tridimensional, (3) establecer un recorrido entre estos dos puntos e (4) incrementar con el dispositivo háptico los valores de intensidad de señal en los vóxeles situados alrededor de dicho recorrido y generar una imagen tridimensional final que contiene una completa reconstrucción de dichas espinas dendríticas.Peer reviewedUniversidad Rey Juan Carlos, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universidad Politécnica de MadridR2 Mención a informe de búsqueda internaciona

Area-Specific Synapse Structure in Branched Posterior Nucleus Axons Reveals a New Level of Complexity in Thalamocortical Networks

Thalamocortical posterior nucleus (Po) axons innervating the vibrissal somatosensory (S1) and motor (MC) cortices are key links in the brain neuronal network that allows rodents to explore the environment whisking with their motile snout vibrissae. Here, using fine-scale high-end 3D electron microscopy, we demonstrate in adult male C57BL/6 wild-type mice marked differences between MC versus S1 Po synapses in (1) bouton and active zone size, (2) neurotransmitter vesicle pool size, (3) distribution of mitochondria around synapses, and (4) proportion of synapses established on dendritic spines and dendritic shafts. These differences are as large, or even more pronounced, than those between Po and ventro-posterior thalamic nucleus synapses in S1. Moreover, using single-axon transfection labeling, we demonstrate that the above differences actually occur on the MC versus the S1 branches of individual Po cell axons that innervate both areas. Along with recently-discovered divergences in efficacy and plasticity, the synaptic structure differences reported here thus reveal a new subcellular level of complexity. This is a finding that upends current models of thalamocortical circuitry, and that might as well illuminate the functional logic of other branched projection axon systems.SIGNIFICANCE STATEMENT Many long-distance brain connections depend on neurons whose branched axons target separate regions. Using 3D electron microscopy and single-cell transfection, we investigated the mouse Posterior thalamic nucleus (Po) cell axons that simultaneously innervate motor and sensory areas of the cerebral cortex involved in whisker movement control. We demonstrate significant differences in the size of the boutons made in each area by individual Po axons, as well as in functionally-relevant parameters in the composition of their synapses. In addition, we found similarly large differences between the synapses of Po versus ventral posteromedial thalamic nucleus axons in the whisker sensory cortex. Area-specific synapse structure in individual axons implies a new, unsuspected level of complexity in long-distance brain connections